Związek szczepów Pseudomonas fluorescens wykorzystywanych do celów konserwatorskich z wibrionami cholery

Konieczność zbadania związku różnych rodzajów mikroorganizmów z wibratorami cholery wiąże się z rozwiązaniem szeregu problemów:

• tworzenie żywych preparatów bakteryjnych do profilaktyki i leczenia cholery, w związku ze światowym wzrostem liczby szczepów patogenu opornych na poliantybiotyki [1];
• Przeprowadzenie badań środowiskowych mających na celu rozwiązanie problemu możliwej endemiczności ognisk cholery związanych przede wszystkim z naturalnymi zbiornikami wodnymi. Analiza biotycznych i abiotycznych czynników wpływających na właściwości biologiczne i przeżywalność Vibrio cholerae w zbiorowiskach wodnych [2].

Znaczenie badania żywotnej aktywności wibrio w ekosystemach wodnych wynika ze znaczenia czynnika wodnego w rozprzestrzenianiu się infekcji. Droga wodna szerzenia się cholery na Ukrainie była główną drogą podczas epidemii w latach 1970, 1977, 1991, 1994, 1995 [1]. Badania eksperymentalne przeprowadzone w ostatnich latach wykazały, że wibratory lepiej przeżywają w wodzie słonawej niż w wodzie słodkiej, tk. obecność jonów sodu jest warunkiem ich wzrostu. Według Ministerstwa Zdrowia Ukrainy w 1998 r. z 811 próbek wody morskiej wyizolowano 260 wibrio nie z grupy O1 (32,1%), ale ze 142 próbek wody rzecznej – 3 (2,11%). W szczytowym momencie epidemii cholery w Odessie w 1970 roku 70,7% zachorowań było związanych z kąpielami w wodzie morskiej zanieczyszczonej nieoczyszczonymi ściekami miejskimi [3].
Należy zauważyć, że antropogenicznemu obciążeniu jednolitych części wód może towarzyszyć intensywny rozwój mikroorganizmów chorobotwórczych i oportunistycznych w wyniku naruszenia mikrosystemu ekologicznego biocenoz naturalnych [4]. W wodzie morskiej w większym stopniu niż w wodzie słodkiej wyraża się antagonistyczne działanie mikroflory. Grigorieva L.V. przytacza dane wielu autorów dotyczące antagonistycznego działania szczepów bakterii morskich na gronkowce, Escherichia coli, grzyby drożdżopodobne i inne mikroorganizmy [5]. W związku z tym badanie przywracania zdolności samooczyszczania się wody morskiej, w tym w odniesieniu do zanieczyszczenia mikrobiologicznego, niewątpliwie wymaga uwagi ekologów, mikrobiologów i innych specjalistów. W ostatnich latach szeroko stosowane są preparaty mikroorganizmów-biodestruktorów do zwalczania ropopochodnych zanieczyszczeń zbiorników wodnych, do których należą monokultury lub zespoły ponad 20 rodzajów mikroorganizmów utleniających ropę, których stężenie w roztworach roboczych jest dość wysokie – 105– 106 komórek drobnoustrojów na ml [6]. Zbiorniki wodne tradycyjnie zanieczyszczone produktami ropopochodnymi to wody portowe i tereny przylegające do dużych ośrodków przemysłowych. W warunkach Odessy te same strefy są obiektami zanieczyszczenia ściekami. W związku z tym postawiliśmy sobie za zadanie zbadanie wpływu szczepów Pseudomonas wchodzących w skład preparatu Econadin, biodestruktora węglowodorów ropopochodnych, na V. cholerae.
Użyliśmy 8 szczepów Vibrio cholerae z Muzeum Kultur Bakteryjnych UkrNIPCz. W tym 1 szczep Vibrio cholerae cholerae 569B, referencyjny producent egzotoksyny cholery, 6 szczepów Vibrio cholerae eltor wyizolowanych od pacjentów podczas epidemii cholery w latach 1994-1995 i 1 szczep Vibrio cholerae non OI wyizolowany z wody morskiej. Wszystkie szczepy były typowe pod względem właściwości morfologicznych, kulturowych i biochemicznych. Z naturalnych econiches (środowiska oceanicznego) wyizolowano szczepy Pseudomonas fluorescens, destruktory węglowodorów olejowych, wchodzące w skład preparatu Econadin. Bakterie zostały kompleksowo przebadane pod kątem braku właściwości chorobotwórczych i inwazyjnych; nieszkodliwe dla ludzi, zwierząt i hydrobiontów, nie wykazują potencjalnej aktywności genetycznej.
Biorąc pod uwagę, że w warunkach naturalnych interakcja mikroorganizmów może zachodzić zarówno na poziomie „kolonialnym”, jak i na poziomie poszczególnych komórek, przeprowadzono badanie modelu asocjacyjnego „vibrio-pseudomonas” na płynnych i stałych pożywkach. W doświadczeniach z zawiesinami mikrobiologicznymi zastosowaliśmy metodę oznaczania indeksu antagonistycznego według metody Nissle’a zmodyfikowanej przez L. G. Peretza i E. M. Slavskaya. Codzienne hodowle bulionowe rozcieńczano pożywką do 500 milionów komórek drobnoustrojów na 1 ml zgodnie ze standardem optycznym. Do probówek z 4 ml pożywki „doświadczalnej” dodano 1 ml kultury vibrio i 0,1 ml kultury pseudomonady. Równolegle inokulowano kontrole wzrostu bakterii w stężeniach odpowiadających doświadczeniu. W pracy Schillera I.G. wykazano możliwość przejścia z jednego typu relacji do innego (np. obojętnego do antagonistycznego) w zależności od zastosowanej pożywki [6]. Dlatego antagonizm określono jednocześnie na bulionie mięsno-peptonowym (MPB) i sterylnej wodzie morskiej. Hodowlę prowadzono w 37°C i 22°C przez 48 godzin. Po 24 i 48 godzinach wysiano 1 standardową ezę bakteriologiczną na agar zasadowy i mięsno-peptonowy. Następnie policzono liczbę kolonii i określono wskaźnik antagonistyczny (ile kolonii vibrio przypada na 100 kolonii pseudomonad).
Oznaczenie zależności na podłożu stałym (agar z peptonem mięsnym) badano metodą opóźnionego antagonizmu Frederica w temperaturach hodowli 37°C i 22°C.
Na stałej pożywce w różnych temperaturach hodowli wszystkie szczepy vibrio były obojętne na Pseudomonas. Na płynnych pożywkach we wszystkich seriach doświadczeń antagonistyczne działanie Pseudomonas na szczepy Vibrio cholerae cholerae 569B i Vibrio cholerae eltor wykazano dla 7 z 8 szczepów pobranych w doświadczeniu. Zahamowanie wzrostu Vibrio w różnym stopniu odnotowano po 24 i 48 godzinach hodowli. Jednocześnie Pseudomonas wykazywały największą aktywność antagonistyczną, aż do całkowitego zahamowania wzrostu, w stosunku do Vibrio cholerae cholerae 569B we wszystkich warunkach uprawy. W stosunku do szczepu Vibrio cholerae non O1 nie stwierdzono działania antagonistycznego w ujęciu ilościowym. Zaobserwowano jednak pojawienie się znacznej liczby kolonii o mniejszej wielkości w stosunku do nasion kontrolnych po 48 godzinach kokultywacji. Porównując średnie wartości aktywności antagonistycznej Pseudomonas na różnych podłożach hodowlanych z wiarygodnością Р  5% stwierdzono, że najniższe wartości uzyskano na BCH po 48 godzinach; wysoki – na wodzie morskiej. Po zmianie reżimu temperaturowego z 37С na 22С, spadek wskaźników antagonistycznych (wzrost aktywności antagonistycznej) został ujawniony po 48 godzinach hodowli na wszystkich podłożach. Przez 24 godziny różnicę tę odnotowano jedynie w wodzie morskiej, co może wynikać z szybszego tempa wzrostu wibrio. Nie stwierdzono istotnych różnic w działaniu zastosowanych szczepów Pseudomonas na wibratory.
W ten sposób uzyskano nowe dane dotyczące pokrewieństwa Pseudomonas wykorzystywanego do celów środowiskowych z V. cholerae. Stwierdzone różnice w relacjach wibrio i pseudomonad w ośrodkach płynnych i stałych mogą zachodzić również w obiektach środowiskowych, gdzie interakcja mikroorganizmów zachodzi z reguły w ośrodkach granicznych (na poziomie kolonialnym iw zawiesinach bakteryjnych). Obecność substratów do przyczepiania się i rozmnażania vibrios na poziomie kolonii (muł, biomasa itp.) może zmniejszać antagonistyczne działanie Pseudomonas. Jednocześnie szczepy Pseudomonas w składzie preparatu są sorbowane na podłożu (torfie) i mogą zyskać przewagę w interakcji z zawiesinami vibrio. Wprowadzanie takich szczepów Pseudomonas do zbiorników wodnych zanieczyszczonych bakteriami o wysokim wibriotitrze będzie oczywiście sprzyjać ich samooczyszczaniu. Kwestia wymaga dalszych badań.