Konservācijas nolūkos izmantoto Pseudomonas Fluorescens celmu saistība ar holēras vibrioniem

Nepieciešamība izpētīt dažāda veida mikroorganismu attiecības ar holēras vibrioniem ir saistīta ar vairāku problēmu risinājumu:

• dzīvu baktēriju preparātu radīšana holēras profilaksei un ārstēšanai saistībā ar pret poliantibiotikām rezistentu patogēna celmu pieaugumu pasaulē [1];
• Vides pētījumu veikšana, lai risinātu jautājumu par iespējamo holēras perēkļu endēmiskumu, kas galvenokārt saistīti ar dabiskajām ūdenstilpēm. To biotisko un abiotisko faktoru analīze, kas ietekmē Vibrio cholerae bioloģiskās īpašības un izdzīvošanu ūdens kopienās [2].

Vibrio vitālās aktivitātes izpētes aktualitāte ūdens ekosistēmās ir saistīta ar ūdens faktora nozīmi infekcijas izplatīšanā. Holēras izplatības ūdensceļš Ukrainā bija galvenais 1970., 1977., 1991., 1994., 1995. gada uzliesmojuma laikā [1]. Pēdējo gadu eksperimentālie pētījumi liecina, ka vibrioni labāk izdzīvo iesāļā ūdenī nekā saldūdenī, tk. nātrija jonu klātbūtne ir priekšnoteikums to augšanai. Saskaņā ar Ukrainas Veselības ministrijas datiem 1998.gadā no 811 jūras ūdens paraugiem 260 vibrioni tika izolēti nevis no O1 grupas (32,1%), bet no 142 upju ūdens paraugiem – 3 (2,11%). Holēras uzliesmojuma kulminācijas laikā Odesā 1970. gadā 70,7% slimību bija saistītas ar peldēšanos jūras ūdenī, kas bija piesārņots ar neattīrītu pilsētas kanalizāciju [3].
Jāņem vērā, ka antropogēno slodzi uz ūdenstilpēm var pavadīt intensīva patogēno un oportūnistisko mikroorganismu attīstība, jo tiek pārkāpta dabisko biocenožu ekoloģiskā mikrosistēma [4]. Jūras ūdenī lielākā mērā nekā saldūdenī izpaužas mikrofloras antagonistiskā iedarbība. Grigorjeva L.V. citē vairāku autoru datus par jūras baktēriju celmu antagonistisko iedarbību uz stafilokokiem, Escherichia coli, rauga sēnītēm un citiem mikroorganismiem [5]. Šajā sakarā jūras ūdens pašattīrīšanās spēju atjaunošanas izpēte, tai skaitā saistībā ar mikrobu piesārņojumu, neapšaubāmi prasa ekologu, mikrobiologu un citu speciālistu uzmanību. Pēdējos gados ūdenstilpju naftas piesārņojuma apkarošanai plaši tiek izmantoti mikroorganismu-biodestruktoru preparāti, kas ietver monokultūras vai vairāk nekā 20 veidu eļļu oksidējošu mikroorganismu asociācijas, kuru koncentrācija darba šķīdumos ir diezgan augsta – 105– 106 mikrobu šūnas uz ml [6]. Ar naftas produktiem tradicionāli piesārņotās ūdenstilpes ir ostu akvatorija un teritorijas, kas pieguļ lieliem rūpniecības centriem. Odesas apstākļos šīs pašas zonas ir notekūdeņu piesārņojuma objekti. Šajā sakarā mēs izvirzījām uzdevumu izpētīt Pseudomonas celmu, kas ir daļa no Econadin preparāta, kas ir naftas ogļūdeņražu biodestruktors, ietekmi uz V. cholerae.
Mēs izmantojām 8 Vibrio cholerae celmus no UkrNIPCh baktēriju kultūru muzeja. Tostarp 1 Vibrio cholerae cholerae 569B celms, holēras eksotoksīna references ražotājs, 6 Vibrio cholerae eltor celmi, kas izolēti no pacientiem holēras uzliesmojuma laikā no 1994. līdz 1995. gadam, un 1 Vibrio cholerae celms, kas izolēts no jūras ūdens, kas nav OI. Visi celmi bija tipiski pēc to morfoloģiskajām, kultūras un bioķīmiskajām īpašībām. Pseudomonas fluorescens celmi, naftas ogļūdeņražu iznīcinātāji, kas ir daļa no Econadin preparāta, tika izolēti no dabiskajām ekonikām (okeāna vide). Baktērijas ir vispusīgi pārbaudītas, lai noteiktu, vai tām nav patogēnu un invazīvu īpašību; nekaitīgi cilvēkiem, dzīvniekiem un hidrobiontiem, tiem nav potenciālas ģenētiskas aktivitātes.
Ņemot vērā, ka dabiskos apstākļos mikroorganismu mijiedarbība var notikt gan “koloniālā” līmenī, gan atsevišķu šūnu līmenī, tika veikta asociatīvā modeļa “vibrio-pseudomonas” izpēte uz šķidrām un cietām barotnēm. Eksperimentos ar mikrobu suspensijām mēs izmantojām antagonistiskā indeksa noteikšanas metodi pēc L. G. Peretz un E. M. Slavskaya modificētās Nisle metodes. Ikdienas buljona kultūras tika atšķaidītas ar barotni līdz 500 miljoniem mikrobu šūnu uz 1 ml saskaņā ar optisko standartu. Mēģenēs ar 4 ml “eksperimentālās” barotnes pievienoja 1 ml vibrio kultūras un 0,1 ml pseidomonādu kultūras. Paralēli tika inokulētas baktēriju augšanas kontroles koncentrācijās, kas atbilst eksperimentam. Šillera darbā I.G. tika parādīta pārejas iespēja no viena attiecību veida uz otru (piemēram, vienaldzīga pret antagonistisku) atkarībā no izmantotās barojošās vides [6]. Tāpēc antagonisms tika noteikts vienlaikus ar gaļas-peptona buljonu (MPB) un sterilu jūras ūdeni. Kultivēšana tika veikta 37 ° C un 22 ° C temperatūrā 48 stundas. Pēc 24 un 48 stundām uz sārmaina un gaļas-peptona agara tika uzsēta 1 standarta bakterioloģiskā cilpa. Pēc tam tika saskaitīts koloniju skaits un noteikts antagonistiskais indekss (cik vibrio koloniju uz 100 pseidomonādu kolonijām).
Attiecību noteikšana uz cietas barotnes (gaļas peptona agara) tika pētīta, izmantojot aizkavētā antagonisma metodi pēc Frederika pie kultivēšanas temperatūras 37°C un 22°C.
Uz cietas barotnes dažādās kultivēšanas temperatūrās visi vibrio celmi bija vienaldzīgi pret Pseudomonas. Uz šķidrām barotnēm visās eksperimentu sērijās Pseudomonas antagonistiskā iedarbība uz Vibrio cholerae cholerae 569B un Vibrio cholerae eltor celmiem tika atklāta 7 no 8 eksperimentā ņemtajiem celmiem. Dažādas pakāpes vibrācijas augšanas kavēšana tika reģistrēta pēc 24 un 48 stundu kultivēšanas. Tajā pašā laikā pseidomonādiem bija vislielākā antagonistiskā aktivitāte līdz pat pilnīgai augšanas kavēšanai attiecībā pret Vibrio cholerae cholerae 569B visos audzēšanas apstākļos. Attiecībā uz Vibrio cholerae non O1 celmu kvantitatīvā izteiksmē antagonistisks efekts netika konstatēts. Tomēr tika novērots ievērojams skaits mazāku koloniju, salīdzinot ar kontroles sēklām, pēc 48 stundu kopkultūras. Salīdzinot vidējos Pseudomonas antagonistiskās aktivitātes rādītājus uz dažādām kultivēšanas barotnēm ar ticamību Р  5%, tika konstatēts, ka zemākie rādītāji iegūti BCH pēc 48 stundām; augstu – uz jūras ūdens. Mainot temperatūras režīmu no 37С uz 22С, pēc 48 stundu kultivēšanas visās barotnēs atklājās antagonistisko rādītāju samazināšanās (antagonistiskās aktivitātes pieaugums). 24 stundas šī atšķirība tika reģistrēta tikai jūras ūdenī, kas varētu būt saistīts ar lielāku vibrio augšanas ātrumu. Nebija būtisku atšķirību izmantoto Pseudomonas celmu iedarbībā uz vibrioniem.
Tādējādi iegūti jauni dati par vides nolūkos izmantoto Pseudomonas saistību ar V. cholerae. Konstatētās atšķirības vibrio un pseidomonādu attiecībās šķidrā un cietā vidē var rasties arī vides objektos, kur mikroorganismu mijiedarbība parasti notiek robežvidēs (koloniālā līmenī un baktēriju suspensijās). Substrātu klātbūtne vibrio piestiprināšanai un atveidošanai koloniju līmenī (dūņas, biomasa utt.) var samazināt Pseudomonas antagonistisko iedarbību. Tajā pašā laikā preparāta sastāvā esošie Pseudomonas celmi tiek sorbēti uz substrāta (kūdras) un var iegūt priekšrocības, mijiedarbojoties ar vibrio suspensijām. Šādu Pseudomonas celmu ievadīšana bakteriāli piesārņotās ūdenstilpēs ar augstu vibriotieru acīmredzami veicinās to pašattīrīšanos. Jautājums prasa turpmāku izpēti.