Връзка на щамове Pseudomonas Fluorescens, използвани за целите на опазването, с холерни вибриони

Необходимостта от изследване на връзката на различни видове микроорганизми с холерни вибриони е свързана с решаването на редица проблеми:

• създаване на живи бактериални препарати за профилактика и лечение на холера, във връзка с глобалното увеличаване на резистентните към полиантибиотици щамове на патогена [1];
• Провеждане на екологични проучвания, насочени към решаване на въпроса за възможната ендемичност на огнищата на холера, свързани предимно с естествени водни тела. Анализ на биотични и абиотични фактори, влияещи върху биологичните свойства и оцеляването на Vibrio cholerae във водни общности [2].

Уместността на изучаването на жизнената активност на вибрионите във водните екосистеми се дължи на значението на водния фактор в разпространението на инфекцията. Водният път на разпространение на холерата в Украйна беше основният по време на огнищата от 1970, 1977, 1991, 1994, 1995 г. [1]. Експериментални проучвания през последните години показват, че вибрионите оцеляват по-добре в солена вода, отколкото в прясна вода, т.к. наличието на натриеви йони е предпоставка за растежа им. Според Министерството на здравеопазването на Украйна през 1998 г. от 811 проби от морска вода са изолирани 260 вибриона не от групата O1 (32,1%), а от 142 проби от речна вода – 3 (2,11%). По време на пика на епидемията от холера в Одеса през 1970 г. 70,7% от заболяванията са били свързани с къпане в морска вода, замърсена от непречистена градска канализация [3].
Трябва да се отбележи, че антропогенното натоварване на водните тела може да бъде придружено от интензивно развитие на патогенни и условно патогенни микроорганизми, което се дължи на нарушаване на екологичната микросистема на естествените биоценози [4]. В морската вода, в по-голяма степен, отколкото в сладката вода, се изразява антагонистичният ефект на микрофлората. Григориева Л.В. цитира данни на редица автори за антагонистичния ефект на щамове морски бактерии върху стафилококи, Escherichia coli, дрождеподобни гъбички и други микроорганизми [5]. В тази връзка изследването на възстановяването на самопречистващата способност на морската вода, включително във връзка с микробно замърсяване, несъмнено изисква вниманието на еколози, микробиолози и други специалисти. През последните години препаратите от микроорганизми-биодеструктори са широко използвани за борба с нефтеното замърсяване на водни обекти, които включват монокултури или асоциации на повече от 20 вида нефтени окисляващи микроорганизми, концентрацията на които в работните разтвори е доста висока – 105– 106 микробни клетки на ml [6]. Традиционно замърсените с нефтопродукти водни обекти включват пристанищни води и райони в близост до големи индустриални центрове. В условията на Одеса същите тези зони са обекти на замърсяване с отпадни води. В тази връзка си поставихме за задача да проучим ефекта върху V. cholerae на щамове Pseudomonas, които са част от препарата Econadin, биодеструктор на петролни въглеводороди.
Използвахме 8 щама Vibrio cholerae от Музея на бактериалните култури на UkrNIPCh. Включително 1 щам на Vibrio cholerae cholerae 569B, референтен производител на холерен екзотоксин, 6 щама на Vibrio cholerae eltor, изолирани от пациенти по време на епидемията от холера през 1994-1995 г., и 1 щам на Vibrio cholerae non OI, изолиран от морска вода. Всички щамове бяха типични по своите морфологични, културни и биохимични свойства. Щамове Pseudomonas fluorescens, деструктори на нефтени въглеводороди, които са част от препарата Econadin, са изолирани от естествени еконики (океанска среда). Бактериите са изчерпателно тествани за липса на патогенни и инвазивни свойства; безвредни за хора, животни и хидробионти, нямат потенциална генетична активност.
Като се има предвид, че при естествени условия взаимодействието на микроорганизмите може да се случи както на „колониално“ ниво, така и на ниво отделни клетки, изследването на асоциативния модел „vibrio-pseudomonas“ беше извършено върху течни и твърди хранителни среди. В експерименти с микробни суспензии използвахме метода за определяне на антагонистичния индекс по метода на Nissle, модифициран от L. G. Peretz и E. M. Slavskaya. Ежедневните бульонни култури се разреждат с хранителна среда до 500 милиона микробни клетки на 1 ml съгласно оптичен стандарт. В епруветки с 4 ml „опитна“ среда се добавят 1 ml култура на вибриони и 0,1 ml култура на псевдомонади. Успоредно с това, контролите на бактериалния растеж бяха инокулирани в концентрации, съответстващи на експеримента. В работата на Шилер I.G. беше показана възможността за преход от един тип връзка към друг (например безразличен към антагонистичен) в зависимост от използваната хранителна среда [6]. Следователно, антагонизмът се определя едновременно върху месно-пептонен бульон (MPB) и стерилна морска вода. Култивирането се провежда при 37°С и 22°С в продължение на 48 часа. След 24 и 48 часа се посява 1 стандартна бактериологична бримка върху алкален и мезо-пептонен агар. След това се преброява броят на колониите и се определя антагонистичният индекс (колко вибрионни колонии на 100 псевдомонадни колонии).
Определянето на връзките върху твърда среда (месен пептонен агар) е изследвано с помощта на метода на забавения антагонизъм според Frederic при температури на култивиране от 37°C и 22°C.
Върху твърда хранителна среда при различни температури на култивиране всички щамове вибриони са индиферентни към Pseudomonas. На течни среди във всички серии от експерименти, антагонистичният ефект на Pseudomonas върху щамовете на Vibrio cholerae cholerae 569B и Vibrio cholerae eltor беше разкрит при 7 от 8 щама, взети в експеримента. Инхибиране на растежа на вибрионите в различна степен е регистрирано след 24 и 48 часа култивиране. В същото време псевдомонадите показват най-голяма антагонистична активност, до пълно инхибиране на растежа, по отношение на Vibrio cholerae cholerae 569B при всички условия на култивиране. По отношение на щама Vibrio cholerae non O1 не е установен антагонистичен ефект в количествено отношение. Въпреки това, беше отбелязано появата на значителен брой колонии с по-малък размер в сравнение с контролните посеви след 48 часа съвместно култивиране. При сравняване на средните стойности на антагонистичната активност на Pseudomonas върху различни среди за култивиране с надеждност Р  5%, беше установено, че най-ниските стойности са получени на BCH след 48 часа; високо – на морска вода. При промяна на температурния режим от 37С на 22С се наблюдава намаляване на антагонистичните показатели (повишаване на антагонистичната активност) след 48 часа култивиране на всички среди. За 24 часа тази разлика е регистрирана само в морска вода, което може да се дължи на по-високата скорост на растеж на вибрионите. Няма значими разлики в ефекта на използваните щамове Pseudomonas върху вибрионите.
По този начин са получени нови данни за връзката на Pseudomonas, използван за екологични цели, с V. cholerae. Установените разлики в отношенията между вибриони и псевдомонади в течна и твърда среда могат да се осъществят и в обекти на околната среда, където взаимодействието на микроорганизмите се случва, като правило, в гранични среди (на колониално ниво и в бактериални суспензии). Наличието на субстрати за прикрепване и възпроизвеждане на вибриони на ниво колонии (тиня, биомаса и др.) може да намали антагонистичния ефект на Pseudomonas. В същото време щамовете Pseudomonas в състава на препарата се сорбират върху субстрата (торф) и могат да получат предимство при взаимодействие със суспензии на вибриони. Въвеждането на такива щамове на Pseudomonas в бактериално замърсени водоеми с висок вибриотитър очевидно ще насърчи тяхното самопречистване. Въпросът изисква допълнително проучване.