Взаємовідносини штамів Pseudomonas Fluorescens, що використовуються в природоохоронних цілях, із холерними вібріонами

Необхідність вивчення взаємовідносин різних видів мікроорганізмів із холерними вібріонами пов’язана з вирішенням низки завдань:

• створення живих бактерійних препаратів для профілактики та лікування холери у зв’язку з глобальним збільшенням поліантибіотикорезистентних штамів збудника [1];
• проведення екологічних досліджень, спрямованих на вирішення питання про можливу ендемічність вогнищ холери, що первинно пов’язані з природними водоймищами. Аналіз біотичних та абіотичних факторів, що впливають на біологічні властивості та виживання холерних вібріонів у водних спільнотах [2].

Актуальність вивчення життєдіяльності вібріонів у водних екосистемах обумовлена значенням водного фактора у поширенні інфекції. Водний шлях поширення холери в Україні був основним у період спалахів 1970, 1977, 1991, 1994, 1995 [1]. Експериментальні дослідження останніх років показали, що вібріони краще виживають у солонуватій воді, ніж у прісній, т.к. наявність іонів натрію є обов’язковою умовою їхнього зростання. За даними МОЗ України у 1998 році з 811 проб морської води було виділено 260 вібріонів не О1 групи (32,1%), а із 142 проб річкової води – 3 (2,11%). У період піку спалаху холери в Одесі в 1970 році 70,7% захворювань були пов’язані з купанням у морській воді, забрудненою не знешкодженими стоками міської каналізації [3].
Слід зазначити, що антропогенне навантаження на водоймища може супроводжуватися інтенсивним розвитком патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, за рахунок порушення екологічної мікросистеми природних біоценозів [4]. У морській воді більшою мірою, ніж у воді прісних водойм виражено антагоністичну дію мікрофлори. Григор’єва Л.В. наводить дані ряду авторів про антагоністичну дію штамів морських бактерій на стафілококи, кишкову паличку, дріжджоподібні гриби та інші мікроорганізми [5]. У зв’язку з цим вивчення питань відновлення самоочищувальної здатності морської води, у тому числі і по відношенню до мікробного забруднення, безсумнівно вимагає уваги екологів, мікробіологів та інших фахівців. В останні роки для боротьби з нафтозабрудненням водойм широко використовують препарати мікроорганізмів-біодеструкторів, до складу яких входять монокультури або асоціації більше 20 видів нафтоокисляючих мікроорганізмів, концентрація яких у робочих розчинах досить висока – 105 – 106 мікробних клітин в мл [6]. До традиційно забруднених нафтопродуктами водойм відносять акваторії портів і зони, що прилягають до великих промислових центрів. В умовах Одеси ці ж зони є об’єктами забруднення стічними водами. У зв’язку з цим ми поставили завдання вивчити вплив штамів псевдомонад, що входять до складу препарату «Еконадін» – біодеструктора вуглеводнів нафти на холерні вібріони.
У роботі використано 8 штамів холерних вібріонів з музею бактеріальних культур УкрНДПЧі. У тому числі 1 штам Vibrio cholerae cholerae 569B, еталонний продуцент холерного екзотоксин, 6 – Vibrio cholerae eltor, виділених від хворих в період спалаху холери 1994-1995 років, і 1 – Vibrio cholerae non. Усі штами були типовими за своїми морфологічними, культуральними та біохімічними властивостями. Штами Pseudomonas fluorescens – деструктори вуглеводнів нафти, що входять до складу препарату “Еконадин”, були виділені з природних еконіш (океанської середовища). Бактерії пройшли всебічну перевірку на відсутність патогенних та інвазивних властивостей; нешкідливі для людини, тварин і гідробіонтів, не мають потенційно-генетичної активності.
Враховуючи, що у природних умовах взаємодія мікроорганізмів може відбуватися як на «колоніальному» рівні, так і на рівні окремих клітин, вивчення асоціативної моделі «вібріони-псевдомонади» проводили на рідких та щільних живильних середовищах. У дослідах з мікробними суспензією використовували методику визначення антагоністичного індексу за методом Ніссле в модифікації Л. Г. Перетца та Є. М. Славської. Добові бульйонні культури розбавляли живильним середовищем до 500 млн. мікробних клітин на 1 мл за оптичним стандартом. У пробірки з 4 мл «дослідного» середовища вносили по 1 мл культури вібріонів та 0,1 мл культури псевдомонад. Паралельно засівали контролі зростання бактерій у концентраціях, що відповідають досвіду. Діяльність Шиллера І.Г. була показана можливість переходу одних типів взаємовідносин до інших (наприклад, індиферентних до антагоністичних) залежно від використовуваного живильного середовища [6]. Тому антагонізм визначали одночасно на м’ясопептонному бульйоні (МПБ) та стерильній морській воді. Культивування проводили при 37С та 22С протягом 48 годин. Через 24 та 48 годин висівали по 1 стандартній бактеріологічній петлі на лужній та м’ясопептонний агар. Потім підраховували число колоній та визначали антагоністичний індекс (скільки колоній вібріонів припадає на 100 колоній псевдомонад).
Визначення взаємовідносин на щільному середовищі (м’ясопептонному агарі) вивчали за допомогою методу відстроченого антагонізму за Фредеріком при температурах культивування 37 С і 22 С.
На щільному поживному середовищі за різних температур культивування всі штами вібріонів перебували в індиферентних відносинах з псевдомонадами. На рідких середовищах у всіх серіях дослідів виявлено антагоністичну дію псевдомонад на штами Vibrio cholerae 569B і Vibrio cholerae eltor – до 7 з 8 штамів, взятих в експеримент. Пригнічення зростання вібріонів різного ступеня реєструвалося через 24 та 48 годин культивування. При цьому найбільшу антагоністичну активність, аж до повного пригнічення росту, псевдомонади виявили по відношенню до Vibrio cholerae 569B за всіх умов культивування. Стосовно штаму Vibrio cholerae non O1 антагоністичну дію в кількісних показниках не виявлено. Однак відзначено появу значної кількості колоній меншого розміру щодо контрольних висівів після 48 годин спільного культивування. При порівнянні середніх показників антагоністичної активності псевдомонад на різних середовищах культивування з достовірністю Р 5% встановлено, що найнижчі показники були отримані на МПБ через 48 годин; високі – на морській воді. При зміні температурного режиму з 37°С до 22°С виявлено зниження антагоністичних індексів (збільшення антагоністичної активності) через 48 годин культивування на всіх середовищах. Для 24 годин цю відмінність реєстрували тільки на морській воді, що можливо пояснюється більшою швидкістю зростання вібріонів. Достовірних відмінностей щодо дії використаних штамів псевдомонад на вібріони не виявлено.
Таким чином, отримані нові дані про взаємини псевдомонад, що використовуються в природоохоронних цілях з холерними вібріонами. Встановлені відмінності у взаєминах вібріонів і псевдомонад на рідких і щільних середовищах можуть мати місце і в об’єктах навколишнього середовища, де взаємодія мікроорганізмів відбувається, як правило, у прикордонних середовищах (на колоніальному рівні та у суспензіях бактерій). Наявність субстратів для прикріплення та розмноження вібріонів на рівні колоній (мул, біомаса тощо) можливо знизить антагоністичну дію псевдомонад. У той же час штами псевдомонад у складі препарату сорбовані на субстраті (торфі) і можуть отримати перевагу при взаємодії із суспензією вібріонів. Інтродукція таких штамів псевдомонад у бактеріально забруднені водоймища, з високим вібріотитром, очевидно, сприятиме їх самоочищенню. Питання потребує подальшого вивчення.