Relatie van Pseudomonas Fluorescens-stammen gebruikt voor milieudoeleinden met choleravebrionen

De noodzaak om de relatie van verschillende soorten micro-organismen met choleravibrio’s te bestuderen gaat gepaard met de oplossing van een aantal problemen:

• creatie van levende bacteriële preparaten voor de preventie en behandeling van cholera, in verband met de wereldwijde toename van polyantibioticaresistente stammen van de ziekteverwekker [1];
• Het uitvoeren van milieustudies gericht op het aanpakken van de kwestie van de mogelijke endemiciteit van choleragebieden die voornamelijk geassocieerd worden met natuurlijke waterlichamen. Analyse van biotische en abiotische factoren die de biologische eigenschappen en overleving van Vibrio cholerae in aquatische gemeenschappen beïnvloeden [2].

De relevantie van het bestuderen van de vitale activiteit van vibrio’s in aquatische ecosystemen is te wijten aan het belang van de factor water in de verspreiding van de infectie. De verspreiding van cholera in Oekraïne verliep vooral via het water tijdens de uitbraken van 1970, 1977, 1991, 1994, 1995 [1]. Experimentele studies in de afgelopen jaren hebben aangetoond dat vibrio’s beter overleven in brak water dan in zoet water, tk. de aanwezigheid van natriumionen is een voorwaarde voor hun groei. Volgens het Ministerie van Gezondheid van Oekraïne werden in 1998 uit 811 monsters van zeewater 260 vibrio’s geïsoleerd die niet tot de O1-groep behoorden (32,1%), maar uit 142 monsters van rivierwater – 3 (2,11%). Tijdens het hoogtepunt van de cholera-uitbraak in Odessa in 1970 werd 70,7% van de ziektegevallen in verband gebracht met baden in zeewater dat besmet was met onbehandeld stadsrioolwater [3].

Opgemerkt moet worden dat de antropogene belasting van waterlichamen gepaard kan gaan met een intensieve ontwikkeling van pathogene en opportunistische micro-organismen, als gevolg van de schending van het ecologische microsysteem van natuurlijke biocenoses [4]. In zeewater komt het antagonistische effect van de microflora meer tot uiting dan in zoet water. Grigorieva L.V. citeert de gegevens van een aantal auteurs over het antagonistische effect van mariene bacteriestammen op stafylokokken, Escherichia coli, gistachtige schimmels en andere micro-organismen [5]. In dit verband vereist de studie van het herstel van het zelfreinigend vermogen van zeewater, ook in relatie tot microbiële verontreiniging, ongetwijfeld de aandacht van ecologen, microbiologen en andere specialisten. In de afgelopen jaren zijn preparaten van micro-organismen-biodestructoren op grote schaal gebruikt om olievervuiling van waterlichamen te bestrijden. Deze preparaten omvatten monoculturen of associaties van meer dan 20 soorten olie-oxiderende micro-organismen, waarvan de concentratie in werkoplossingen vrij hoog is – 105-106 microbiële cellen per ml [6]. Waterlichamen die traditioneel vervuild zijn met olieproducten zijn havenwateren en gebieden die grenzen aan grote industriële centra. In Odessa zijn deze zelfde zones objecten van vervuiling door rioolwater. In dit verband hebben we de taak op ons genomen om het effect van Pseudomonas-stammen, die deel uitmaken van het Econadin-preparaat, een biodestructor van petroleumkoolwaterstoffen, op V. cholerae te bestuderen.
We gebruikten 8 stammen van Vibrio cholerae uit het Museum van Bacteriële Culturen van het UkrNIPCh. Waaronder 1 stam van Vibrio cholerae cholerae 569B, een referentieproducent van cholera-exotoxine, 6 stammen van Vibrio cholerae eltor geïsoleerd uit patiënten tijdens de cholera-uitbraak van 1994-1995, en 1 stam van Vibrio cholerae non OI geïsoleerd uit zeewater. Alle stammen waren typisch in hun morfologische, culturele en biochemische eigenschappen. Pseudomonas fluorescens-stammen, destructoren van olie-koolwaterstoffen, die deel uitmaken van het Econadin-preparaat, werden geïsoleerd uit natuurlijke economen (oceaanmilieu). De bacteriën zijn uitvoerig getest op de afwezigheid van pathogene en invasieve eigenschappen; ze zijn onschadelijk voor mensen, dieren en hydrobionten en hebben geen potentiële genetische activiteit.
Omdat onder natuurlijke omstandigheden de interactie van micro-organismen zowel op “koloniaal” niveau als op het niveau van individuele cellen kan plaatsvinden, werd de studie van het associatieve model “vibrio-pseudomonas” uitgevoerd op vloeibare en vaste voedingsbodems. In experimenten met microbiële suspensies gebruikten we de methode voor het bepalen van de antagonistische index volgens de Nissle-methode, gemodificeerd door L. G. Peretz en E. M. Slavskaya. Dagelijkse bouillonculturen werden verdund met een voedingsbodem tot 500 miljoen microbiële cellen per 1 ml volgens een optische standaard. In reageerbuizen met 4 ml “experimenteel” medium werd 1 ml vibriokweek en 0,1 ml pseudomonadenkweek toegevoegd. Tegelijkertijd werden bacteriële groeicontroles geënt in concentraties die overeenkwamen met het experiment. In het werk van Schiller I.G. werd de mogelijkheid aangetoond van de overgang van het ene type relatie naar het andere (bijvoorbeeld onverschillig tot antagonistisch) afhankelijk van het gebruikte voedingsmedium [6]. Daarom werd het antagonisme gelijktijdig bepaald op vleespeptonbouillon (MPB) en steriel zeewater. Er werd gekweekt bij 37°C en 22°C gedurende 48 uur. Na 24 en 48 uur werd 1 standaard bacteriologische lus uitgezaaid op alkaline en vleespepton agar. Vervolgens werd het aantal kolonies geteld en de antagonistische index bepaald (hoeveel vibriokolonies per 100 pseudomonadenkolonies).
De bepaling van de relaties op vast medium (vleespepton agar) werd bestudeerd met de methode van vertraagd antagonisme volgens Frederic bij kweektemperaturen van 37°C en 22°C.
Op een vast voedingsmedium bij verschillende kweektemperaturen waren alle vibrio stammen onverschillig tegenover Pseudomonas. Op een vloeibaar medium werd in alle series experimenten het antagonistische effect van Pseudomonas op stammen van Vibrio cholerae cholerae 569B en Vibrio cholerae eltor aangetoond bij 7 van de 8 stammen die aan het experiment deelnamen. De groeiremming van Vibrio varieerde na 24 en 48 uur kweken. Tegelijkertijd vertoonden pseudomonaden de grootste antagonistische activiteit, tot volledige groeiremming, in relatie tot Vibrio cholerae cholerae 569B onder alle kweekomstandigheden. Met betrekking tot de Vibrio cholerae non O1 stam werd geen antagonistisch effect gevonden in kwantitatieve termen. Er werd echter wel een significant aantal kolonies met een kleinere omvang ten opzichte van de controlezaailingen gevonden na 48 uur co-cultivatie. Bij het vergelijken van de gemiddelde indicatoren van de antagonistische activiteit van Pseudomonas op verschillende kweekmedia met een betrouwbaarheid van Р  5%, bleek dat de laagste indicatoren werden verkregen op BCH na 48 uur; hoog – op zeewater. Toen het temperatuurregime werd veranderd van 37С naar 22С, werd na 48 uur kweken op alle media een afname in antagonistische indices (een toename in antagonistische activiteit) gevonden. Voor 24 uur werd dit verschil alleen geregistreerd in zeewater, wat te wijten kan zijn aan de hogere groeisnelheid van vibrios. Er waren geen significante verschillen in het effect van de gebruikte Pseudomonas-stammen op vibrios.
Er zijn dus nieuwe gegevens verkregen over de relatie van Pseudomonas die voor milieudoeleinden worden gebruikt met V. cholerae. De vastgestelde verschillen in de relatie tussen vibrio’s en pseudomonaden in vloeibare en vaste media kunnen ook plaatsvinden in milieu-objecten, waar de interactie van micro-organismen in de regel plaatsvindt in grensmedia (op koloniaal niveau en in bacteriesuspensies). De aanwezigheid van substraten voor de aanhechting en voortplanting van vibrio’s op het niveau van kolonies (slib, biomassa, etc.) kan het antagonistische effect van Pseudomonas verminderen. Tegelijkertijd worden Pseudomonas-stammen in de samenstelling van het preparaat gesorbeerd op het substraat (turf) en kunnen ze een voordeel hebben bij interactie met vibrio suspensies. De introductie van dergelijke Pseudomonas-stammen in bacterieel besmette waterlichamen met een hoge vibriotiter zal uiteraard hun zelfzuivering bevorderen. Deze kwestie vereist verder onderzoek.