Relația dintre tulpinile de Pseudomonas Fluorescens utilizate în scopuri de conservare și vibrionii de holeră

Necesitatea de a studia relația diferitelor tipuri de microorganisme cu vibrionii holeric este asociată cu soluționarea unui număr de probleme:

• crearea de preparate bacteriene vii pentru prevenirea și tratarea holerei, în legătură cu creșterea globală a tulpinilor de agent patogen rezistente la poliantibiotice [1];
• Efectuarea de studii de mediu menite să abordeze problema posibilei endemicități a focarelor de holeră asociate în primul rând cu corpurile naturale de apă. Analiza factorilor biotici și abiotici care afectează proprietățile biologice și supraviețuirea Vibrio cholerae în comunitățile acvatice [2].

Relevanța studierii activității vitale a vibriilor în ecosistemele acvatice se datorează importanței factorului apă în răspândirea infecției. Calea apei de răspândire a holerei în Ucraina a fost cea principală în timpul focarelor din 1970, 1977, 1991, 1994, 1995 [1]. Studiile experimentale din ultimii ani au arătat că vibrionii supraviețuiesc mai bine în apa sălmată decât în apa dulce, tk. prezența ionilor de sodiu este o condiție prealabilă pentru creșterea acestora. Potrivit Ministerului Sănătății al Ucrainei în 1998, din 811 probe de apă de mare, 260 de vibrioni au fost izolați nu din grupa O1 (32,1%), ci din 142 de probe de apă de râu – 3 (2,11%). În perioada de vârf a focarului de holeră din Odesa în 1970, 70,7% dintre boli au fost asociate cu îmbăierea în apă de mare contaminată de canalizarea orașului netratată [3].
Trebuie menționat că încărcarea antropică asupra corpurilor de apă poate fi însoțită de dezvoltarea intensivă a microorganismelor patogene și oportuniste, din cauza încălcării microsistemului ecologic al biocenozelor naturale [4]. În apa de mare, într-o măsură mai mare decât în apa dulce, se exprimă efectul antagonic al microflorei. Grigorieva L.V. citează datele unui număr de autori cu privire la efectul antagonic al tulpinilor de bacterii marine asupra stafilococilor, Escherichia coli, ciupercilor asemănătoare drojdiei și a altor microorganisme [5]. În acest sens, studiul restabilirii capacității de auto-purificare a apei de mare, inclusiv în ceea ce privește poluarea microbiană, necesită fără îndoială atenția ecologiștilor, microbiologilor și a altor specialiști. În ultimii ani, preparatele de microorganisme-biodestructoare au fost utilizate pe scară largă pentru combaterea poluării cu petrol a corpurilor de apă, care includ monoculturi sau asociații a peste 20 de tipuri de microorganisme oxidante de ulei, a căror concentrație în soluțiile de lucru este destul de mare – 105– 106 celule microbiene per ml [6]. Corpurile de apă poluate în mod tradițional cu produse petroliere includ apele portuare și zone adiacente marilor centre industriale. În condițiile din Odesa, aceleași zone sunt obiecte de poluare cu canalizare. În acest sens, ne-am propus să studiem efectul tulpinilor de Pseudomonas, care fac parte din preparatul Econadin, un biodestructor al hidrocarburilor petroliere, asupra V. cholerae.
Am folosit 8 tulpini de Vibrio cholerae de la Muzeul Culturilor Bacteriene din UkrNIPCh. Inclusiv 1 tulpină de Vibrio cholerae cholerae 569B, un producător de referință de exotoxină holeră, 6 tulpini de Vibrio cholerae eltor izolate de la pacienți în timpul focarului de holeră din 1994-1995 și 1 tulpină de Vibrio cholerae non OI izolată din apa de mare. Toate tulpinile au fost tipice în proprietățile lor morfologice, culturale și biochimice. Din econichele naturale (mediul oceanic) au fost izolate tulpini de Pseudomonas fluorescens, destructori de hidrocarburi petroliere, care fac parte din preparatul Econadin. Bacteriile au fost testate cuprinzător pentru absența proprietăților patogene și invazive; inofensive pentru oameni, animale și hidrobionți, nu au activitate genetică potențială.
Având în vedere că în condiții naturale interacțiunea microorganismelor se poate produce atât la nivel „colonial”, cât și la nivelul celulelor individuale, studiul modelului asociativ „vibrio-pseudomonas” a fost realizat pe medii nutritive lichide și solide. În experimentele cu suspensii microbiene am folosit metoda de determinare a indicelui antagonist conform metodei Nissle modificată de L. G. Peretz și E. M. Slavskaya. Culturile zilnice de bulion au fost diluate cu un mediu nutritiv la 500 de milioane de celule microbiene per 1 ml conform unui standard optic. În eprubete cu 4 ml de mediu „experimental” s-au adăugat 1 ml de cultură de vibrio și 0,1 ml de cultură de pseudomonadă. În paralel, martorii de creștere bacteriană au fost inoculați la concentrații corespunzătoare experimentului. În opera lui Schiller I.G. s-a arătat posibilitatea trecerii de la un tip de relație la altul (de exemplu, indiferent la antagonist) în funcție de mediul nutritiv utilizat [6]. Prin urmare, antagonismul a fost determinat simultan pe bulionul de carne-peptonă (MPB) și apa de mare sterilă. Cultivarea a fost efectuată la 37°C și 22°C timp de 48 de ore. După 24 și 48 de ore, 1 buclă bacteriologică standard a fost însămânțată pe agar alcalin și peptonă de carne. Apoi s-a numărat numărul de colonii și s-a determinat indicele antagonist (câte colonii de vibrio la 100 de colonii de pseudomonade).
Determinarea relațiilor pe mediu solid (agar peptonă de carne) a fost studiată folosind metoda antagonismului întârziat conform lui Frederic la temperaturi de cultivare de 37°C și 22°C.
Pe un mediu nutritiv solid la diferite temperaturi de cultivare, toate tulpinile de vibrio au fost indiferente față de Pseudomonas. Pe medii lichide în toate seriile de experimente, efectul antagonic al Pseudomonas asupra tulpinilor de Vibrio cholerae cholerae 569B și Vibrio cholerae eltor a fost dezvăluit la 7 din 8 tulpini luate în experiment. Inhibarea creșterii vibrio-ului în diferite grade a fost înregistrată după 24 și 48 de ore de cultivare. În același timp, pseudomonadele au prezentat cea mai mare activitate antagonistă, până la inhibarea completă a creșterii, în raport cu Vibrio cholerae cholerae 569B în toate condițiile de cultivare. În raport cu tulpina Vibrio cholerae non O1, nu a fost găsit niciun efect antagonic din punct de vedere cantitativ. Cu toate acestea, s-a observat apariția unui număr semnificativ de colonii de dimensiuni mai mici față de însămânțarile martor după 48 de ore de co-cultivare. La compararea indicatorilor medii ai activității antagoniste a Pseudomonas pe diverse medii de cultură cu o fiabilitate de Р  5%, s-a constatat că cei mai mici indicatori au fost obținuți pe BCH după 48 de ore; înalt – pe apa mării. Când regimul de temperatură a fost schimbat de la 37С la 22С, a fost evidențiată o scădere a indicilor antagonişti (o creștere a activității antagoniste) după 48 de ore de cultivare pe toate mediile. Timp de 24 de ore, această diferență a fost înregistrată doar în apa de mare, ceea ce se poate datora ratei mai mari de creștere a vibriilor. Nu au existat diferențe semnificative în ceea ce privește efectul tulpinilor utilizate de Pseudomonas asupra vibrioșilor.
Astfel, au fost obținute noi date privind relația dintre Pseudomonas utilizat în scopuri de mediu cu V. cholerae. Diferențele stabilite în relația dintre vibrioni și pseudomonade în mediile lichide și solide pot avea loc și în obiectele din mediu, unde interacțiunea microorganismelor are loc, de regulă, în mediile limită (la nivel colonial și în suspensii bacteriene). Prezența substraturilor pentru atașarea și reproducerea vibrionilor la nivelul coloniilor (silt, biomasă etc.) poate reduce efectul antagonist al Pseudomonas. În același timp, tulpinile de Pseudomonas din compoziția preparatului sunt absorbite pe substrat (turbă) și pot obține un avantaj atunci când interacționează cu suspensiile de vibrio. Introducerea unor astfel de tulpini de Pseudomonas în corpurile de apă contaminate cu bacterii cu vibriotitru ridicat va promova în mod evident autopurificarea acestora. Problema necesită un studiu suplimentar.