Взаимоотношения штаммов Pseudomonas Fluorescens, используемых в природоохранных целях, с холерными вибрионами

Необходимость изучения взаимоотношений различных видов микроорганизмов с холерными вибрионами связано с решением ряда задач:

• создание живых бактерийных препаратов для профилактики и лечения холеры, в связи с глобальным увеличением полиантибиотикорезистентных штаммов возбудителя [1];
• проведение экологических исследований, направленных на решение вопроса о возможной эндемичности очагов холеры, первично связанных с природными водоемами. Анализ биотических и абиотических факторов, влияющих на биологические свойства и выживаемость холерных вибрионов в водных сообществах [2].

Актуальность изучения жизнедеятельности вибрионов в водных экосистемах обусловлена значением водного фактора в распространении инфекции. Водный путь распространения холеры в Украине был основным в период вспышек 1970, 1977, 1991, 1994, 1995 годов [1]. Экспе-риментальные исследования последних лет показали, что вибрионы лучше выживают в солоноватой воде, чем в пресной, т.к. наличие ионов натрия является обязательным условием их роста. По данным МОЗ Украины в 1998 году из 811 проб морской воды было выделено 260 вибрионов не О1 группы (32,1%), а из 142 проб речной воды – 3 (2,11%). В период пика вспышки холеры в Одессе в 1970 году 70,7% заболеваний были связаны с купанием в морской воде, загрязненной необезвреженными стоками городской канализации [3].
Следует отметить, что антропогенная нагрузка на водоемы может сопровождаться интенсивным развитием патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, за счет нарушения экологической микросистемы естественных биоценозов [4]. В морской воде в большей степени, чем в воде пресных водоемов выражено антагонистическое действие микрофлоры. Григорьева Л.В. приводит данные ряда авторов об антагонистическом действии штаммов морских бактерий на стафилококки, кишечную палочку, дрожжеподобные грибы и другие микроорганизмы [5]. В связи с этим изучение вопросов восстановления самоочищающей способности морской воды, в том числе и по отношению к микробному загрязнению, несомненно требует внимания экологов, микробиологов и других специалистов. В последние годы для борьбы с нефтезагрязнением водоемов широко используют препараты микроорганизмов-биодеструкторов, в состав которых входят монокультуры или ассоциации более 20 видов нефтеокисляющих микроорганизмов, концентрация которых в рабочих растворах достаточно высока – 105 – 106 микробных клеток в мл [6]. К традиционно загрязненным нефтепродуктами водоемам относят акватории портов и зоны, прилегающие к крупным промышленным центрам. В условиях Одессы эти же зоны являются объектами загрязнения сточными водами. В связи с этим мы поставили задачу изучить влияние штаммов псевдомонад, входящих в состав препарата «Эконадин» — биодеструктора углеводородов нефти, на холерные вибрионы.
В работе использовали 8 штаммов холерных вибрионов из музея бактериальных культур УкрНИПЧи. В том числе 1 штамм Vibrio cholerae cholerae 569B, эталонный продуцент холерного экзотоксина, 6 – Vibrio cholerae eltor, выделенных от больных в период вспышки холеры 1994-1995 годов, и 1 – Vibrio cholerae non OI, изолированный из морской воды. Все штаммы были типичными по своим морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Штаммы Pseudomonas fluorescens – деструкторы углеводородов нефти, входящие в состав препарата “Эконадин”, были выделены из природных экониш (океанской среды). Бактерии прошли всестороннюю проверку на отсутствие патогенных и инвазивных свойств; безвредны для человека, животных и гидробионтов, не обладают потенциально-генетической активностью.
Учитывая, что в естественных условиях взаимодействие микроорганизмов может происходить как на «колониальном» уровне, так и на уровне отдельных клеток, изучение ассоциативной модели «вибрионы-псевдомонады» проводили на жидких и плотных питательных средах. В опытах с микробными взвесями использовали методику определения антагонистического индекса по методу Ниссле в модификации Л. Г. Перетца и Е. М. Славской. Суточные бульонные культуры разбавляли питательной средой до 500 млн. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту. В пробирки с 4 мл «опытной» среды вносили по 1 мл культуры вибрионов и 0,1 мл культуры псевдомонад. Параллельно засевали контроли роста бактерий в концентрациях, соответствующих опыту. В работе Шиллера И.Г. была показана возможность перехода одних типов взаимоотношений в другие (например, индифферентных в антагонистические) в зависимости от используемой питательной среды [6]. Поэтому антагонизм определяли одновременно на мясопептонном бульоне (МПБ) и стерильной морской воде. Культивирование проводили при 37 С и 22 С в течение 48 часов. Через 24 и 48 часов высевали по 1 стандартной бактериологической петле на щелочной и мясопептонный агар. Затем подсчитывали число колоний и определяли антагонистический индекс (сколько колоний вибрионов приходится на 100 колоний псевдомонад).
Определение взаимоотношений на плотной среде (мясопептонном агаре) изучали с помощью метода отсроченного антагонизма по Фредерику при температурах культивирования 37 С и 22 С.
На плотной питательной среде при различных температурах культивирования все штаммы вибрионов находились в индифферентных отношениях с псевдомонадами. На жидких средах во всех сериях опытов выявлено антагонистическое действие псевдомонад на штаммы Vibrio cholerae cholerae 569B и Vibrio cholerae eltor – к 7 из 8 штаммов, взятых в эксперимент. Угнетение роста вибрионов различной степени регистрировалось через 24 и 48 часов культивирования. При этом наибольшую антагонистическую активность, вплоть до полного угнетения роста, псевдомонады проявили по отношению к Vibrio cholerae cholerae 569B при всех условиях культивирования. По отношению к штамму Vibrio cholerae non O1 антагонистическое действие в количественных показателях не обнаружено. Однако отмечено появление значительного числа колоний меньшего размера относительно контрольных высевов, после 48 часов совместного культивирования. При сравнении средних показателей антагонистической активности псевдомонад на различных средах культивирования с достоверностью Р  5% установлено, что самые низкие показатели были получены на МПБ через 48 часов; высокие – на морской воде. При изменении температурного режима с 37С до 22С выявлено снижение антагонистических индексов (увеличение антагонистической активности) через 48 часов культивирования на всех средах. Для 24 часов это различие регистрировали только на морской воде, что возможно объясняется большей скоростью роста вибрионов. Достоверных различий в отношении действия использованных штаммов псевдомонад на вибрионы не обнаружено.
Таким образом, получены новые данные о взаимоотношении псевдомонад, используемых в природоохранных целях, с холерными вибрионами. Установленные отличия во взаимоотношениях вибрионов и псевдомонад на жидких и плотных средах могут иметь место и в объектах окружающей среды, где взаимодействие микроорганизмов происходит, как правило, в пограничных средах (на колониальном уровне и во взвесях бактерий). Наличие субстратов для прикрепления и размножения вибрионов на уровне колоний (ил, биомасса и т.д.) возможно снизит антагонистическое действие псевдомонад. В то же время штаммы псевдомонад в составе препарата сорбированы на субстрате (торфе) и могут получить преимущество при взаимодействии со взвесями вибрионов. Интродукция таких штаммов псевдомонад в бактериально загрязненные водоемы, с высоким вибриотитром, очевидно, будет способствовать их самоочищению. Вопрос требует дальнейшего изучения.